Фотоiнактивацiя in vitro Staphylococcus aureus свiтлом рiзних дiлянок видимого спектру

Abstract

Питання ефективної антисептичної обробки в медицинi залишається актуальним i його вирiшення спонукає до пошуку нових засобiв впливу на патогенну мiкрофлору. Фотодинамiчна терапiя є альтернативним до антибiотикiв сучасним методом iнактивацiї патогенних мiкроорганiзмiв, що заснований на використаннi рiзних фотобiологiчних ефектiв, що викликаються за допомогою поєднаного застосування свiтлового випромiнювання, кисню i фотосенсибiлiзатора. Перевагами такого пiдходу є вiдсутнiсть селективностi та розвитку резистентностi бактерiй. Як вiдомо, жорстке ультрафiолетове випромiнювання застосовують для стерилiзацiї поверхонь, медичних iнструментiв тощо. Свiтло даного дiапазону хвиль однаково шкiдливе як для прокарiотичних, так i для еукарiотичних клiтин, що й обмежує сферу його застосування. За певних умов свiтло з бiльшою довжиною хвилi також може виявляти антимiкробну дiю. Якщо у бактерiальних клiтинах присутнi специфiчнi речовини — фотосенсибiлiзатори, якi мають максимуми поглинання у дiлянках електромагнiтного спектру — при опромiненнi такi сполуки взаємодiють iз оточуючими молекулами, зокрема кисню, i генерують утворення токсичних для клiтин вiльних радикалiв. Дослiджували дiю свiтла з довжинами хвиль 390, 460, 530 нм та комплексний ефект червоного свiтла (660 нм) iз фотосенсибiлiзатором метиленовим синiм на iнактивацiю in vitro диких штамiв Staphylococcus aureus. Мiкроорганiзми отримували на середовищi жовтково-сольового агару (ЖСА). Оцiнку чутливостi мiкроорганiзмiв до дiї свiтла вiдповiдної довжини хвилi проводили у суспензiї бактерiй, яку готували у середовищi Мюллера-Хiнтона. Суспензiю iнкубували на водянiй банi 20 хв при 37◦С. Опромiнення суспензiї проводили монохроматичним свiтлом 390, 460, 530 та 660 нм (Lika–Led, Фотонiка Плюс, Черкаси) з емiсiєю 0,1 Дж/с та часовою дискретизацiєю 2 хв. Розрахунок дози опромiнення (Дж/мл) проводили вiдносно об’єму суспензiї бактерiй, що становила 10 мл. Ефективнiсть бактерицидної дiї свiтла (%) оцiнювали при порiвняннi опромiнених зразкiв з контрольними, якi перебували в аналогiчних умовах, але не пiддавалися дiї свiтла. Дослiдження дiї свiтла з довжиною хвилi 390 нм та енергiєю емiсiї 0,1 Дж/с показали високу бактерицидну ефективнiсть при дозi опромiнення 10– 11 Дж/мл бактерiальної суспензiї, в результатi чого гине 50% КУО. При менших дозах опромiнення виявлено iнактивацiю близько 40% мiкроорганiзмiв вiд початкової популяцiї. Наступне збiльшення енергiї сприяє лiнiйному зростанню бактерицидної активностi свiтла. Виявлено, що при активацiї синiм свiтлом 460 нм з дозою опромiнення менше, нiж 1,5 Дж/мл, вiдбувається слабка iнiцiацiя загибелi бактерiальних клiтин та iнактивується лише 4–5% КУО. Подальше збiльшення дози опромiнення до 10 Дж/мл забезпечує лiнiйне зменшення кiлькостi КУО до 40% вiд початкової популяцiї з виходом на плато. Дiя зеленого свiтла з довжиною хвилi 530 нм має близьку до синього ефективнiсть. Початкова доза опромiнення, необхiдна для iнiцiацiї загибелi бактерiй у суспензiї становить 2,5–3 Дж/мл, а її збiльшення сприяє рiзкому зниженню кiлькостi КУО на 35%. Подальше зростання сумарної енергiї опромiнення виявляє значно меншу ефективнiсть. Максимальний бактерицидний ефект становить 50% при дозi 14–16 Дж/мл. Метиленовий синiй виявляє слабкi бактерициднi ефекти при концентрацiях вище 0,01%. У нашому дослiдженнi виявлено, що при дозi опромiнення 1– 1,5 Дж/мл та присутностi у суспензiї 0,0001% метиленового синього кiлькiсть КУО у знижується на 25%. Максимальний ефект комплексної дiї свiтла та сенсибiлiзатора досягається при дозi опромiнення 4,5–5 Дж/мл i становить 55–60%. Опромiнення in vitro диких штамiв Staphylococcus aureus свiтлом з довжинами хвиль 390, 460 i 530 нм забезпечує iнактивацiю бiльш нiж половини КУО у суспензiї клiтин. Завдяки комплекснiй дiї червоного свiтла (660 нм), яке має найвищу проникну здатнiсть у тканини, та сенсибiлiзатора метиленового синього при концентрацiї 0,0001% досягається висока бактерицидна активнiсть при дозi опромiнення 4,5–5 Дж/мл.

Photodynamic therapy is an alternative method of inactivation of pathogenic microorganisms. The advantages of this approach are the lack of selectivity and the development of sustainability. Hard ultraviolet irradiation is used to sterilize surfaces and some medical devices. It is equally harmful to prokaryotic and eukaryotic cells, which limits its scope. However, light wi-th longer wavelengths also has an antimicrobial effect. It is possible due to presence of specific substances in bacterial cells such as photosensitizes, which have absorption maxima in the parts of the electromagnetic spectrum that they are irradiated. Due to the ability of photosensitizes to interact with surroundi-ng molecules the free radicals are generated. The target of study was determination of the antimicrobial effect of light irrradiation with wavelengths of 390, 460, 530 nm. The synergistic effect of red light (660 nm) in combination with 0.0001% methylene blue on inhibition of growth of Staphylococcus aureus in vitro was observed. Wild strains of Staphylococcus aureus were obtained on yolk-salt agar. The sensitivity of microorganisms to the light irradiation was evaluated in a suspension of bacteria. Mueller-Hinton medium was used for suspension preparation. The suspension was incubated in a water bath for 20 minutes at 37◦C. Each experiment has control one for assessing the rate of bacterial reproduction. Suspension was irradiated with monochromatic light at 390, 460, 530 and 660 nm (Lika-Led, Photonika Plus, Cherkasy) with an emission of 0.1 J/s and a time discretization of 2 min. The calculation of the dose of radiation (J/ml) in 10 ml bacteria suspension was carried out. The bactericidal effectiveness of light (%) was evaluated by comparing the irradiated samples with controls, which were not exposed to light. The number of colonies forming units (CFU) of S. aureus in the suspension was calculated in a Goryaev chamber. Bacteria were contrasted with 3.5 · 10−3 M acridine orange for 3 minutes. Mathematical and statistical data analysis was performed in the Originlab 8.0 software package. The experiment was repeated three times. Light irradiation with a wavelength of 390 nm and energy of 0.1 J/s has showed good bactericidal efficiency. It was shown, that irradiation dose of 10–11 J/ml leads to death of 50% CFU in bacterial suspension. At lower irradiation dose about 40% of microorganisms were death. An increase of energy leads to increase in the bactericidal activity of light. It was found that an irradiation dose of 1.5 J/ml of blue light at 460 nm initiates the death of bacteria and contributes to the inactivation of 4–5% CFU. A further increasing of dose to 10 J/ml provides a decrease the number of CFU up to 60%. An irradiation with green light at530 nm causes similar 460 nm effects. The required irradiation dose for the death of bacteria in suspension is 2.5–3 J/ml. An increase the last one contributes to a dramatic decrease in the number of CFU up to 35%. A further increase in the total irradiation energy is less effective. The maximum bactericidal effect is 50% at a dose of 14–16 J/ml. Methylene blue has a weak bactericidal effect at concentrations above 0.01%. It was found that at a dose of 1–1.5 J/ml (660 nm) and the presence of 0.0001% methylene blue in the suspension, the number of CFU is reduced by 25%. The maximum effect of 55–60% at a 4.5–5 J/ml was achieved. Photodynamic therapy is a low-energy light at wavelengths of 390, 460 and 530 nm provides inactivation over half CFU of S. aureus in vitro. Combination of methylene blue 0.0001% and red light (660 nm) irradiation provide a high bactericidal effectiveness at irradiation dose 4.5–5 J/ml.